文献前沿：牙髓干细胞来源小细胞外囊泡发挥“一石二鸟”作用，有望治疗牙周炎

当牙周炎、类风湿关节炎等炎症性疾病发生时，巨噬细胞被募集并极化为M1促炎表型。这些长期活动的M1巨噬细胞随后产生高水平的NO、活性氧和促炎细胞因子，导致持续的炎症反应。促炎细胞因子可促进成骨细胞产生RANKL的受体激活剂，导致破骨细胞过度形成，从而破坏骨稳态。

间充质干细胞（MSCs）因具有强大的免疫调节能力而被广泛用于各种炎症性疾病的治疗，包括牙周炎。越来越多的证据表明，MSCs的治疗效果主要归因于其分泌的旁分泌因子，其中最关键的是细胞外囊泡（EV），包括外泌体（EXO）、小细胞外囊泡（sEV）。有研究表明，MSC-sEV在免疫调节和诱导组织修复再生等治疗效果上与MSC类似，且在安全性、存储和给药方面比MSC疗法更具优势，因此被认为是一种大有潜力的治疗方法。

牙髓干细胞（DPSCs）是从成人牙髓中分离出来的一种间充质干细胞，其容易获得，且不会引起任何伦理问题。据报道，牙髓干细胞来源小细胞外囊泡（DPSC-sEV)显示出比骨髓间充质干细胞来源小细胞外囊泡（BMSC-sEV）更强的免疫调节作用。不过，DPSC-sEV能否直接抑制巨噬细胞的炎症反应和破骨细胞的生成，目前还是一个未知数。此外，体外培养的MSCs通常暴露在常氧（21% O2）条件下，而体内相当一部分MSCs存在于低氧环境中（2%-8%），那么在低氧条件下产生的DPSC-sEV是否能发挥更好的治疗效果？

为此，中山大学附属口腔医院的研究团队发现，低氧诱导的DPSC-sEV通过调节巨噬细胞极化和破骨细胞生成来改善炎症性骨溶解。这项成果于近日发表在《Bioactive Materials》杂志上，有望为骨髓炎、牙周炎、类风湿关节炎等常见病的治疗带来一种新策略。

文献封面截图[1]

研究材料与方法

研究人员从SD大鼠上颌中切牙的牙髓中分离出DPSCs，并鉴定了DPSCs的成骨分化和成脂分化能力（OriCell®MSC成脂诱导分化试剂盒、OriCell®茜素红染色液、OriCell®油红O染色液等产品为该项研究助力）。

之后，研究人员从DPSCs中分离出小细胞外囊泡（sEV），并开展了一系列的分析。在体内研究中，使用了LPS诱导的小鼠颅骨炎性骨吸收模型，体外研究则使用了RAW264.7巨噬细胞。

技术路线

从DPSCs中分离出sEV，发现低氧诱导了DPSCs的sEV释放

Hypo-sEV诱导巨噬细胞M2极化并抑制破骨细胞生成，从而改善了LPS诱导的炎症性骨吸收

通过miRNA表达谱分析等实验，发现Hypo-sEV的治疗效果是由miR-210-3p介导的

miR-210-3p通过抑制NF-κB1 p105表达，来调节巨噬细胞的炎症反应和破骨细胞的形成

研究结果

01

Hypo-sEV促进巨噬细胞M2极化并抑制破骨细胞生成

在分离出DPSCs后，研究人员经过流式分析和免疫荧光分析，确认培养的DPSCs具有MSC的间质表型，并具备多潜能分化能力。随后，他们通过超速离心法从常氧（normoxic conditions）和低氧(hypoxic conditions)条件下培养的DPSCs上清液中分离出sEV，分别命名为Nor-sEV和Hypo-sEV。结果发现，这两种sEV都表现出典型的EV特征，但Hypo-sEV的浓度更高，且蛋白质浓度也明显更高。而且，通过sEV蛋白标志物分析，发现低氧明显增加诱导了DPSCs释放sEV。

为了比较这两种sEV对炎症性骨溶解的治疗效果，研究人员使用了LPS诱导的小鼠炎症性骨吸收模型。通过micro-CT扫描和组织学检查评估，他们发现Nor-sEV对LPS诱导的骨溶解未能表现出明显的治疗效果。相反，Hypo-sEV挽救了小鼠颅骨基质的炎症性骨溶解，即提高了BV/TV值，并减少了骨侵蚀面积（图1）。这些结果表明，Hypo-sEV明显改善了LPS诱导的体内炎症性骨吸收。

图1. Hypo-sEV在体内抑制LPS诱导的炎症性骨吸收[1]

由于巨噬细胞从M1到M2的表型转变可促进骨修复，故研究人员接着分析了Hypo-sEV是否可促进体内的巨噬细胞M2极化。LPS导致CD68+iNOS+巨噬细胞（M1表型）数量增加，但Hypo-sEV和Nor-sEV的加入使得颅骨基质中出现了更多的CD68+Arg1+巨噬细胞（M2表型），且Hypo-sEV处理后的M1巨噬细胞更少，M2巨噬细胞更多。与Nor-sEV相比，Hypo-sEV明显抑制IL-1β的表达，促进IL-10和Arg1的表达。由此可见，Hypo-sEV可以抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症反应，并诱导巨噬细胞M2极化。

炎症性骨吸收是由破骨细胞的过度生成引起的，因此研究人员还研究了Hypo-sEV是否能抑制体内破骨细胞的生成。他们发现，Nor-sEV和Hypo-sEV都减少了LPS诱导的破骨细胞（TRAP阳性）数量，且Hypo-sEV组的破骨细胞数量低于Nor-sEV组。体外培养实验也表明，这两种sEV抑制了RANKL诱导的破骨细胞分化，且Hypo-sEV组的抑制效果优于Nor-sEV组。这些数据显示，Hypo-sEV在体内和体外直接抑制了破骨细胞生成。

02Hypo-sEV通过上调miR-210-3p表达而发挥作用

为了进一步分析这背后的分子机制，研究人员决定从miRNA研究入手。他们利用新一代测序分析了Nor-sEV和Hypo-sEV的miRNA表达谱。结果发现，与Nor-sEV相比，Hypo-sEV中有45个miRNA上调，64个miRNA下调。在重点关注与巨噬细胞炎症反应或破骨细胞分化有关的miRNA后，他们还发现Hypo-sEV中的miR-7578、miR-187-3p和miR-210-3p水平相对于Nor-sEV升高。后续分析显示，miR-210-3p在介导Hypo-sEV的治疗效果方面发挥了关键作用。

接着，通过对RAW264.7细胞与两种sEV的共培养分析，进一步发现了Hypo-sEV可以将miR-210-3p递送到巨噬细胞和破骨细胞中。miR-210-3p抑制剂提高了促炎细胞因子和iNOS的表达，同时降低了IL-10和Arg1的表达，减弱了Hypo-sEV诱导巨噬细胞M2极化的能力。此外，miR-210-3p抑制剂也部分降低了Hypo-sEV抑制破骨细胞形成的能力以及破骨细胞生成相关基因的表达（图2）。这些结果表明，Hypo-sEV通过上调miR-210-3p表达而诱导巨噬细胞M2极化并抑制破骨细胞生成。

图2. Hypo-sEV在体外通过递送miR-210-3p而诱导巨噬细胞M2极化并抑制破骨细胞生成[1]

之后，实验转移到小鼠模型上继续进行。为了进一步确认Hypo-sEV的治疗效果是由miR-210-3p介导的，研究人员在LPS诱导的炎症性骨吸收模型中使用了miRNA抑制剂antagomir-210-3p。结果显示，antagomir-210-3p明显消除了Hypo-sEV的治疗作用。而且与对照相比，antagomir-210-3p的加入导致M1型巨噬细胞增加，M2型巨噬细胞减少。这些结果证实。miR-210-3p通过诱导巨噬细胞M2极化和抑制破骨细胞生成而明显改善了LPS诱导的炎症性骨溶解。

后续的分析发现，miR-210-3p直接靶向了NF-κB1的3′UTR，而NF-κB通路的激活对巨噬细胞M1极化和破骨细胞生成至关重要。miR-210-3p通过抑制NF-κB1 p105表达来调节巨噬细胞的炎症反应和破骨细胞的形成。

结论

图3. miR-210-3p抑制LPS诱导的炎症性骨吸收的示意图[1]

这项研究表明，低氧预处理不仅诱导了DPSC-sEV的分泌，还增强了DPSC-sEV介导的对LPS诱导的骨溶解的治疗效果。其中，miR-210-3p通过诱导巨噬细胞M2极化和抑制破骨细胞生成来保护骨骼。

因此，低氧诱导的DPSC-sEV和miR-210-3p的这种“一石二鸟”作用有助于开发新策略来治疗炎症性或感染性骨溶解。

文章转载自：OriCell细胞生物学微信公众号