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人源化纳米抗体的纯化,有何挑战?如何应对?

2023-05-23

目前已上市的纳米抗体药物共有三种,包括Ablynx的纳米单抗卡拉西单抗(Caplacizumab)和双特异性抗体Ozoralizumab以及康宁杰瑞的恩沃利单抗(Envafolimab)。此外,还有多个纳米抗体进入到临床研究阶段,广泛分布在包括肿瘤、神经系统疾病、免疫系统疾病等各种领域。

纳米抗体的人源化改造

纳米抗体

纳米抗体由于其穿透性好、结合活性强、稳定性高等特点,使其不仅作为单抗药物性质优越,并且便于开发双特异性抗体药物、抗体药物偶联物(Antibody-drug conjugate, ADC)以及嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor, CAR)细胞药物等,因此广受药物研究者青睐[1]。

驼科动物外周血中会产生两种不同类型的IgG抗体,如下图1所示,一类是由两条重链和两条轻链组成的常规IgG1抗体(MW~150 kDa),另一类则是包括IgG2和IgG3(MW~90 kDa)在内的缺少轻链及重链CH1结构域的重链抗体(HCAb)。重链抗体的可变区称为单域抗体(sdAb),也称为纳米抗体或VHH。VHH被认为是最小的抗原结合单位。

图1 驼科动物外周血中的抗体

人源化改造

为了降低潜在的免疫反应,提高安全性,用于人体的抗体药物常常需要进行人源化改造。由于VHH抗体体积小、具有免疫原性的表位少且血清半衰期较短等,人们普遍认为其免疫原性显著低于传统双链抗体[2]。但是VHH中较长的的CDR1和CDR3区以及非经典的二硫键是人类基因库中不存在的构象(如图2所示),可能存在由构象表位引发的免疫原性的潜在风险。

Noncanonical disulfide linkage

图2 VH与VHH的结构示意图[3]

 

此外,VHH的CDR和FR区高水平的体细胞超突变也限制了VHH与人类免疫球蛋白重链可变区基因(Immunoglobulin heavy-chain variable gene, IGHV)序列的同源性[4]。因此,在开发VHH药物时出于药效及安全性考虑会对驼科VHH进行人源化改造。目前已上市的三款VHH抗体药,均进行了人源化改造。

 

人源化纳米抗体纯化的挑战

为了避免引入更多风险因素,大多情况下制药企业不会在纳米抗体上添加Flag、His等标签蛋白,且纳米抗体的人源化改造可能会导致原本针对驼科纳米抗体的纯化方法不适用,这为人源化纳米抗体的纯化带来了很多障碍。

有些企业会设计Fc融合的纳米抗体,在延长纳米抗体半衰期的同时可以使用Protein A等方式对融合的纳米抗体进行纯化。但是融合Fc的纳米抗体也会失去它分子量小的优势,同时可能会引发非特异性结合(许多细胞具有Fc受体)以及Fc介导的补体反应。

所以有些特定的情况下,还是需要设计Tag-free的纳米抗体药物,但是目前尚无有效的亲和纯化Tag-free的人源化纳米抗体的方法。    

 

应对策略推荐

GenScript开发了Anti-Humanized VHH Affinity Resin FF(GenScript,L00951),可助力人源化纳米抗体的纯化及药物的开发。

结构及原理

Anti-Humanized VHH Affinity Resin FF通过共价偶联的方式将Anti-Humanized VHH Antibody偶联到高度交联的琼脂糖微球上,细胞裂解物中的人源化VHH单域抗体可以与偶联到填料上的Anti-Humanized VHH Antibody特异性结合,从而达到纯化人源化VHH的目的(如图3所示)。

图3 Anti-Humanized VHH Affinity Resin FF

结构和纯化原理示意图

应用场景

Anti- Humanized VHH Affinity Resin FF的填料是在琼脂糖凝胶4B的基础上经过化学交联形成的高度交联的介质,因此化学稳定性和物理刚性显著增强。除了可通过柱层析、批量结合或免疫沉淀(IP)等方式,还能通过各种常规的中低压色谱系统(如AKTA纯化系统)纯化目标蛋白。

该产品的亲和配基Anti-Humanized VHH Antibody对人源化VHH较高的亲和力和特异性使其能够从常用的蛋白质表达系统(如细菌、酵母和哺乳动物细胞)中获得较高纯度的人源化VHH(如图4所示)。

图4 柱层析方式纯化人源化VHH示意图

产品特性

金斯瑞MonoRab™ Anti-Humanized VHH Affinity Resin FF的主要特性如下表:

表1 Anti-Humanized VHH Affinity Resin FF的特性

案例展示

1.Anti-Humanized VHH Affinity Resin FF从E. coli裂解液中纯化人源化VHH#1蛋白。

 

2.Anti-Humanized VHH Affinity Resin FF从E.coli裂解液中纯化人源化VHH#2蛋白。

 

3.Anti-Humanized VHH Affinity Resin FF重复使用次数

 

结果表明,该产品重复使用10次后,载量没有明显下降。

产品推荐

不同规格介质

抗体及抗体标记物

文章转载自金斯瑞目录产品微信公众号

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